Рекомбинантный аллерген

ФС.3.3.1.0001.15 Аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении | Фармстудент

Ресурсы сайта (1449 работ)

ФС.3.3.1.0001.15 Аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Аллерген туберкулезный                               ФС.3.3.1.0001.15

рекомбинантный в                                                Взамен ГФ Х, ст. 706,

стандартном разведении                                ФС 42-19ВС-86

Настоящая фармакопейная статья распространяется на аллерген туберкулезный рекомбинантный, который представляет собой гибридный белок с молекулярной массой около 27 кДа, состоящий из 2 антигенов CFP10-ESAT6, продуцируемый генетически модифицированной культурой Еscherichia соli BL21(DE3)/pCFP-ESAT.

Аллерген туберкулезный рекомбинантный предназначен для диагностики туберкулеза.

ПРОИЗВОДСТВО

Производство препарата аллергена туберкулезного рекомбинантного должно осуществляться с соблюдением установленных правил организации производства и контроля качества генно-инженерных иммунобиологических лекарственных средств, гарантирующих качество и безопасность для человека.

Выращенную культуру клеток бактерий-продуцентов отделяют от среды и лизируют для высвобождения белка. Лизат клеток-продуцентов проходит стадии хроматографического выделения и очистки целевого белка-концентрата.

Очищенный концентрат – полуфабрикат (субстанция) аллергена туберкулезного подлежит проверке на стерильность, отсутствие сенсибилизирующих свойств, содержание белка, специфичность, специфическую активность, аномальную токсичность.

Стандартное разведение аллергена получают путем разведения концентрата изотоническим фосфатным буферным раствором до содержания 0,2 мкг гибридного белка в 0,1 мл.

ИСПЫТАНИЯ

Описание

Бесцветная прозрачная жидкость без посторонних примесей.

Подлинность

Препарат при внутрикожном введении морским свинкам, зараженным тест-штаммом Mycobacteriumtuberculosis, должен вызывать положительные кожные реакции, а у животных, иммунизированных вакциной БЦЖ, реакции должны отсутствовать (разделы «Специфическая активность», «Специфичность»).

Прозрачность

Должен быть прозрачным. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».

Цветность

Должен быть бесцветным. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».

Извлекаемый объем

Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения».

рН

От 7,35 до 7,55. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия»» href=»http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-1-0004-15-ionometriya/»>ОФС «Ионометрия».

Аномальная токсичность

Должен быть нетоксичным. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность»» href=»http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0004-15-anomalnaya-toksichnost/»>ОФС «Аномальная токсичность» на 5 мышах, тест-доза 0,5 мл.

Бактериальные эндотоксины

Не более 5 ЕЭ/мл. Определение проводят в соответствии с ОФС «Бактериальные эндотоксины».

Стерильность

Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность»» href=»http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0003-15-sterilnost/»>ОФС «Стерильность» методом прямого посева или мембранной фильтрации.

Специфическая активность

В 0,1 мл препарата должно содержаться 0,2 мкг аллергена туберкулезного рекомбинантного. Индекс специфической активности должен быть равен (1,00 ± 0,05). Испытание проводят на морских свинках, зараженных живой культурой Mycobacterium tuberculosis.

Морских свинок (альбиносов или белокожих Hartley) массой (350±50) г содержат на постоянном пищевом рационе и в одинаковых условиях окружающей среды. Сенсибилизацию проводят путем заражения животных подкожно или аэрогенно вирулентным штаммом M.tuberculosis.

Используют третью генерацию тест-штамма с плотной среды для выращивания микобактерий. Морских свинок используют для постановки проб не более 2 раз в период от 30 до 120 сут после инфицирования с интервалом между постановками проб не менее 30 сут.

При повторном использовании животных пробы ставят на участках кожи, ранее не подвергавшихся воздействию препаратов.

За 24 ч до постановки туберкулиновых проб шерсть на спине или боках морских свинок удаляют сплошной полосой шириной 3-4 см.

Испытание препарата проводят на 6 зараженных микобактериями туберкулеза морских свинках. Заполняют 4 шприца испытуемым образцом и 4 шприца разведенным (0,2 мкг/0,1 мл) стандартным образцом (СО) аллергена туберкулезного рекомбинантного.

Каждой морской свинке по методу случайных чисел вводят по 0,1 мл внутрикожно 4 пробы испытуемого образца и 4 пробы СО. Реакцию учитывают через 24 ч, измеряя 2 взаимно перпендикулярных диаметра эритемы в мм. Подсчитывают суммы реакций на испытуемый препарат и на СО.

Специфическую активность оценивают по индексу специфической активности (I) – отношению суммы реакций на испытуемый препарат к сумме реакций на разведенный СО при отсутствии достоверных различий между средними реакциями на испытуемый препарат и СО.

Если полученные результаты выходят за указанные пределы, испытание повторяют. Результаты 2 испытаний усредняют.

Специфичность

Морские свинки, иммунизированные вакциной БЦЖ, не должны реагировать на внутрикожное введение 0,2 мкг в 0,1 мл испытуемого аллергена туберкулезного рекомбинантного и давать положительные реакции – папулы диаметром не менее 5 мм на 2 ТЕ в 0,1 мл СО очищенного туберкулина. Испытание проводят на 3 морских свинках не ранее чем через 30 дней после введения им по 0,5 мг вакцины БЦЖ.

Фенол

От 0,20 до 0,30 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Количественное определение фенола спектрофотометрическим методом в иммунобиологических лекарственных препаратах».

Производственные штаммы

Рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pCFP-ESAT — прототрофный штамм E.

coli В (депонирован в ИБХ РАН), который обладает рядом характеристик, отличающих его от штамма предшественника: быстрый рост на минимальной среде, способность к синхронизации, устойчивый рост культуры в условиях биосинтеза белка и недостатка питательных веществ, дефектность системы рестрикции ДНК В-типа.

Штамм несет оригинальную плазмиду pCFP10-ESAT6, содержащую генетическую конструкцию из 2 генов M.tuberculosis –cfp10 и esat 6и ген устойчивости к ампициллину (bla). Штамм устойчив к ампициллину (100 – 150 мкг/мл) и чувствителен к остальным антибиотикам.

Для контроля качества препарата используют тест-штаммы M.tuberculosis (вирулентный) и M. bovis BCG — 1 из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов.

Упаковка и маркировка

В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Транспортирование

При температуре от 2 до 8 оС в условиях, исключающих замораживание. Допускается транспортирование при температуре не выше 18 °С в течение 15 дней.

Хранение

При температуре от 2 до 8 °С. Не замораживать!

Источник: http://farmstudent.ru/fs-3-3-1-0001-15-allergen-tuberkuleznyj-rekombinantnyj-v-standartnom-razvedenii

Новые возможности с рекомбинантными аллергенами › Клиника – Форпост

В составе специфических аллергенов, сейчас возможно также выделить наиболее активные белковые компоненты, которые вызывают выработку IgE антител и аллергические симптомы.

Например, проводя обычный тест на аллергию, выявлена сенсибилизация к аллергену пыльцы березы. Но этот аллерген включает несколько аллергенных компонентов. Это и есть рекомбинантные аллергены.

Рекомбинантные аллергены – это аллергенные молекулы, полученные методом генной инженерии, первоначально выделенные из аллергенного экстракта.

Большинство существующих рекомбинантных аллергенов экспрессированы в клетке Esherichia coli, и по своим структурным и иммунологическим свойствам полностью соответствуют натуральным протеинам. Другие высокотехнологические системы основаны на воспроизведении

рекомбинантных аллергенов в дрожжевой, бактериальной или инсектной клетке.

Рекомбинантные аллергены обладают тем же специфичным свойством к индукции IgE-антител, что и компоненты натуральных экстрактов и обычно демонстрируют высокую чувствительность и специфичность в тестах in vitro и in vivo.

Сегодня множество аллергенных молекул из различных натуральных источников аллергенов могут быть клонированы, секвинированы и экспрессированы как рекомбинантные аллергены.

Использование рекомбинантных аллергенов позволяет выявить сенсибилизацию к компонентам ( специфичным белкам).

Таким образом, использование рекомбинантных аллергенов – это важная информация о триггерных стимулах на молекулярном уровне. Исследование реактивности к рекомбинантным аллергенам дает возможность изучать более сложные популяционные явления, такие как географические различия в IgE-опосредованной чувствительности и перекрестные реакции между различными аллергенами.

• В случае, когда в натуральном экстракте содержание аллергенных компонентов низкое, дополнение основного рекомбинантного белка к экстракту улучшает клиническую чувствительность и количественную постановку теста.

• Рекомбинантные аллергены могут быть объединены для формирования композиции, содержащей оптимальное соотношение основных аллергенных компонентов из натурального экстракта, и исключающих компоненты, имеющие малое диагностическое значение. Это открывает интересные возможности для улучшения качества тестов в будущем.

• Использование тестов на отдельные аллергенные компоненты дополняют традиционные тесты на IgE антитела с целью получения более детальной информации. Возможность исследовать чувствительность к отдельным компонентам аллергена может пролить свет на необъяснимые явления.

• Тестирование с отдельными компонентами используется для более подробного исследования и объяснения аллергической реактивности, а также для определения перекрестной реактивности к различным аллергенам.

Что такое перекрестная аллергия и для чего это нужно

Для пациентов, у которых появляются симптомы после употребления в пищу яблока или других фруктов, обычный тест, основанный на применении экстракта, будет выявлять причиннозначимый аллерген, такой как яблоко, персик, груша. Однако истинной причиной может быть сенсибилизация к пыльце деревьев или трав, перекрестная реакция между компонентами аллергенов, имеющими одинаковую структуру и представленными в пыльце растений и пищевых белках.

Тесты на отдельные аллергеные компоненты могут быть использованы для получения большей информации о причине сенсибилизации на молекулярном уровне, например, к молекулам пыльцы, LTPs или профилинам, и делает возможным сделать выводы врачам о клинических проявлениях.

Так как у пациентов, реагирующих на пыльцу, симптомы проявляются только в определенный сезон, то симптоматическое лечение в период цветения может быть эффективно, а для пациентов чувствительных к LTP еще обязательно необходима элиминационная диета.

К тому же у этих пациентов, вероятно, разовьются более тяжелые симптомы.

Вот объяснение почему ребенок у которого была аллергия к латексной соске со временем дал реакцию на банан или авокадо – наличие рекомбинатных аллергенов ( перекрестная чувствительность, один и тот же по структуре белок аллерген)

Более точный ответ нужна ли СИТ

Рекомбинантные аллергены дают возможность высокоспецифической диагностики, с помощью которой возможно определить объективные критерии для назначения специфической иммунотерапии (СИТ).

Тесты с рекомбинантными аллергенами открывают новые возможности прогнозирования, будет ли назначение СИТ эффективным или нет, и назначения адекватной терапии.

Если аллергические реакции у пациента обусловлены сенсибилизацией к основному компоненту аллергена.

С высокой степенью вероятности можно прогнозировать высокий терапевтический эффект от СИТ с экстрактом пыльцы березы, который будет содержать высокую концентрацию этого компонента.

С другой стороны, если пациент чувствителен к другому, не к главному компоненту аллергена иммунотерапия с экстрактом, возможно будет недостаточно эффективной. Есть также опасения, что СИТ с аллергенными компонентами, к которым пациент не чувствителен, может вызвать развитие новой сенсибилизации, что скорее ухудшит симптомы, чем устранит их.

Иммунологический эффект от проведения СИТ может быть прослежен периодически

по уровню IgE- и IgG – антител к основным рекомбинантным аллергенам. Более того, проведение мониторинга может отследить развитие сенсибилизации к минорным

перекрестно –реагирующим компонентам экстракта.

Компонентная аллергодиагностика – новые подходы

Рекомбинантные аллергены открывают большие перспективы диагностики к молекулярным компонентам. С их помощью возможно определение сенсибилизации пациента к полному аллергенному профилю, включающему как аллергенные

компоненты, вызывающие заболевание, так и перекрестно-реагирующие. Компонентная аллергодиагностика – революционное направление аллергологии.

Разработки в области исследования реактивности к рекомбинантным аллергенам, проводились в компании Phadia в течение многих лет. В испытаниях использовали,

как очищенные натуральные аллергенные компоненты, так и рекомбинантные аллергены. Более 10 лет назад были запущены исследования с первыми рекомбинантными

аллергенами, после чего количество компонентов для диагностики in vitro неуклонно растет. Ученые активно разрабатывают новые рекомбинантные аллерготесты, исследуют их клиническую значимость и ищут пути их применения.

Источник: http://medicine2all.ru/retsepty-narodnoj-meditsiny/allergiya/6255-novye-vozmozhnosti-s-rekombinantnymi-allergenami-klinika-forpost

Аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении – Аллергия – симптомы и лечение

(в ред. Приказа Минздравсоцразвития РФ от 29. 10. 2009 N 855)

Аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении (далее – препарат) представляет собой рекомбинантный белок, продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia coli BL21(DE3) /pCFP-ESAT. Препарат содержит два связанных между собой антигена – CFP10 и ESAT6, присутствующие в вирулентных штаммах микобактерий туберкулеза, в том числе M.tuberculosis и M.bovis.

Эти антигены отсутствуют в штаммах БЦЖ M.bovis, из которого готовятся вакцины туберкулезные – БЦЖ и БЦЖ-М.

Одна доза (0, 1 мл) препарата содержит: рекомбинантный белок CFP10-ESAT6 (0, 2 мкг) , фенол (0, 25 мг) в качестве консерванта, полисорбат 80 (твин 80) в качестве стабилизатора, натрий фосфорно-кислый двузамещенный 2-водный, натрия хлорид, калий фосфорно-кислый однозамещенный, воду для инъекций – до 0, 1 мл.

Биологические и иммунологические свойства.

Препарат предназначен для повышения качества диагностики туберкулезной инфекции. Действие препарата основано на выявлении клеточного иммунного ответа на специфические для микобактерий туберкулеза (далее – МБТ) антигены.

Препарат не обладает сенсибилизирующим действием, не токсичен. При внутрикожном введении вызывает у лиц с туберкулезной инфекцией специфическую кожную реакцию гиперчувствительности замедленного типа (далее – ГЗТ) .

По результатам проведенных исследований установлено, что чувствительность (частота положительных ответных реакций у лиц с активной туберкулезной инфекцией) внутрикожной пробы с препаратом сопоставима с чувствительностью туберкулиновой пробы, а его специфичность (частота отсутствия реакции на препарат у здоровых лиц) выше, чем у туберкулина, так как в отличие от туберкулина у вакцинированных БЦЖ, но не инфицированных МБТ лиц препарат не вызывает ответную реакцию ГЗТ. В связи с тем, что препарат не вызывает реакцию ГЗТ, связанную с вакцинацией БЦЖ, проба с препаратом не может быть использована вместо туберкулинового теста для отбора лиц на первичную вакцинацию и ревакцинацию БЦЖ.

Препарат используется во всех возрастных группах с целью:

1) диагностики туберкулеза и оценки активности процесса;

2) дифференциальной диагностики туберкулеза;

3) дифференциальной диагностики поствакцинальной и инфекционной аллергии (гиперчувствительности замедленного типа) ;

4) наблюдения за эффективностью лечения в комплексе с другими методами.

Назначение.

Для практического использования внутрикожную пробу с препаратом применяют в противотуберкулезных учреждениях или, при отсутствии таковых, по назначению врача-фтизиатра и при его методическом обеспечении.

Для раннего выявления туберкулеза внутрикожную пробу с препаратом проводят:

лицам, направленным в противотуберкулезное учреждение для дообследования на наличие туберкулезного процесса;

лицам, относящимся к группам высокого риска по заболеванию туберкулезом с учетом эпидемиологических, медицинских и социальных факторов риска;

лицам, направленным к фтизиатру по результатам массовой туберкулинодиагностики.

Факторами высокого риска заболевания туберкулезом являются:

1) эпидемиологические (контакт с больным туберкулезом человеком или животным) ;

2) медико-биологические:

сахарный диабет, язвенная болезнь, психоневрологическая патология, частые ОРВИ в анамнезе;

хронические заболевания различных органов и систем при торпидном, волнообразном течении и неэффективности традиционных методов лечения;

длительный прием (более месяца) цитостатических, глюкокортикоидных препаратов, иммунодепрессантов;

ВИЧ-инфекция, перинатальный контакт у детей по ВИЧ-инфекции;

3) социальные:

алкоголизм, наркомания, пребывание в местах лишения свободы, безработица;

беспризорность детей и подростков, попадание детей в детские приюты, детские дома, социальные центры и т.д.;

миграция.

Для дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний внутрикожную пробу с препаратом проводят в комплексе с клинико-лабораторным и рентгенологическим обследованием в условиях противотуберкулезного учреждения.

Для наблюдения за пациентами, состоящими на учете у фтизиатра с различными проявлениями туберкулезной инфекции, в условиях противотуберкулезного учреждения (все контингенты ПТД) внутрикожную пробу с препаратом проводят при контрольном обследовании во всех группах диспансерного учета с интервалом 3 – 6 месяцев.

Способ применения и дозировка.

Назначение и методическое руководство проведением пробы осуществляет врач-фтизиатр. Проба проводится детям, подросткам и взрослым специально обученной медицинской сестрой, имеющей допуск к проведению внутрикожных тестов. Препарат вводят строго внутрикожно.

Для проведения пробы применяют только туберкулиновые шприцы и тонкие короткие иглы с косым срезом. Перед употреблением необходимо проверить дату их выпуска и срок годности. Запрещается применять шприцы, предназначенные для инъекций инсулина.

Резиновую пробку флакона с препаратом обрабатывают 70% этиловым спиртом. Для забора препарата из флакона используется тот же шприц, который будет использован для инъекции (СП 3. 3. 2342-08 от 03. 03.

2008) .

Если туберкулиновые шприцы имеют съемные иглы, пробку флакона прокалывают отдельной иглой для подкожных или внутримышечных инъекций, которую после каждого забора препарата в шприц оставляют в пробке, накрыв стерильной салфеткой.

Туберкулиновым шприцем набирают 0, 2 мл (две дозы) препарата и выпускают раствор до метки 0, 1 мл в стерильный ватный тампон. Флакон с препаратом после вскрытия допускается хранить не более 2 часов в защищенном от света месте.

Пробу проводят обследуемым в положении сидя. После обработки участка кожи на внутренней поверхности средней трети предплечья 70% этиловым спиртом в верхние слои натянутой кожи, параллельно ее поверхности, вводят 0, 1 мл препарата.

При постановке пробы, как правило, в коже образуется папула в виде “лимонной корочки” беловатого цвета диаметром 7 – 10 мм. Если на одном предплечье ставилась проба с туберкулином, препарат вводят в другое предплечье.

Лицам, у которых в анамнезе имелись проявления неспецифической аллергии, пробу рекомендуется проводить на фоне приема десенсибилизирующих препаратов в течение 7 дней (5 дней до постановки пробы и 2 дня после нее) .

Учет и интерпретация результатов.

В учетных документах после постановки пробы с препаратом отмечают:

а) название препарата;

б) предприятие-изготовитель, номер серии, срок годности;

в) дату проведения пробы;

г) результат – реакция на пробу.

Результат пробы оценивает врач или обученная медсестра через 72 часа с момента ее проведения путем измерения поперечного (по отношении к оси предплечья) размера гиперемии и инфильтрата (папулы) в миллиметрах прозрачной линейкой. Гиперемию учитывают только в случае отсутствия инфильтрата.

Ответная реакция на пробу считается:

отрицательной – при полном отсутствии инфильтрата и гиперемии или при наличии “уколочной реакции”;

сомнительной – при наличии гиперемии без инфильтрата;

положительной – при наличии инфильтрата (папулы) любого размера.

Условно различают следующие ответные кожные реакции на препарат:

слабо выраженная – при наличии инфильтрата размером до 5 мм;

умеренно выраженная – при размере инфильтрата 5 – 9 мм;

выраженная – при размере инфильтрата 10 мм и более;

гиперергическая – при размере инфильтрата 15 мм и более, при везикуло-некротических изменениях и (или) лимфангоите, лимфадените независимо от размера инфильтрата.

В отличие от реакции ГЗТ кожные проявления неспецифической аллергии (в основном гиперемия) на препарат, как правило, наблюдаются сразу после постановки пробы и через 48 – 72 ч обычно исчезают.

Отрицательная реакция на пробу.

Кожная ГЗТ к препарату, как правило, отсутствует:

1) у лиц, не инфицированных МБТ;

2) у лиц, ранее инфицированных МБТ с неактивной туберкулезной инфекцией;

3) у больных туберкулезом в период завершения инволюции туберкулезных изменений при отсутствии клинических, рентгено-томографических, инструментальных и лабораторных признаков активности процесса;

4) у лиц, излечившихся от туберкулеза.

Одновременно проба с препаратом может быть отрицательной у больных туберкулезом с выраженными иммунопатологическими нарушениями, обусловленными тяжелым течением туберкулезного процесса, у лиц на ранних стадиях инфицирования МБТ, на ранних стадиях туберкулезного процесса, у лиц, имеющих сопутствующие заболевания, сопровождающиеся иммунодефицитным состоянием. В связи с этим при наличии характерных клинико-рентгенологических признаков туберкулеза отрицательная реакция на препарат не должна препятствовать проведению дальнейших мероприятий по диагностике туберкулезной инфекции.

Лица с сомнительной и положительной реакцией на препарат подлежат обследованию на туберкулез.

Лица старше 18 лет, у которых впервые установлена сомнительная или положительная проба с препаратом, подлежат полному клинико-рентгенологическому обследованию в противотуберкулезном диспансере.

По итогам обследования, при отсутствии у указанной группы лиц признаков локального туберкулеза, им показано наблюдение у фтизиатра по “0” группе диспансерного учета с проведением лечебно-профилактических мероприятий (по показаниям) .

Детям и подросткам при наличии сомнительной или положительной реакции на препарат показано полное обследование на туберкулез с последующим лечением и наблюдением в соответствующей группе диспансерного учета. При отрицательном результате реакции на препарат лечение по поводу туберкулезной инфекции не показано. Повторная постановка пробы – через 2 месяца.

Противопоказания для постановки пробы:

1) острые и хронические (в период обострения) инфекционные заболевания, за исключением случаев, подозрительных на туберкулез;

2) соматические и др. заболевания в период обострения;

3) распространенные кожные заболевания;

5) эпилепсия.

В детских коллективах, где имеется карантин по детским инфекциям, проба проводится только после снятия карантина.

В случаях дифференциальной диагностики локального туберкулеза и других заболеваний, кроме индивидуальной непереносимости туберкулина, противопоказаний для постановки пробы с препаратом не имеется.

Побочное действие.

У отдельных лиц, как и при проведении туберкулинодиагностики, могут наблюдаться кратковременные признаки общей неспецифической реакции: недомогание, головная боль, повышение температуры тела.

Взаимодействие с другими лекарственными препаратами.

Здоровым лицам с отрицательным результатом пробы профилактические прививки (кроме БЦЖ) можно проводить непосредственно после оценки и учета результата пробы.

Если профилактические прививки уже проведены, то пробу с препаратом осуществляют не ранее чем 1 месяц после прививки.

Приложение N 5 от 21 марта 2003 г. N 109

Скачать<\p>

Источник: http://allergiya.my1.ru/news/allergen_tuberkuleznyj_rekombinantnyj_v_standartnom_razvedenii/2016-12-07-24

Аллергокомпонент t215 – Береза rBet v1 PR-10, IgE (ImmunoCAP)

Количественное определение в крови специфических антител класса иммуноглобулинов E к главному («мажорному») аллергену пыльцы березы – Betv1 белку PR-10, выявление которых позволяет диагностировать истинную аллергию к пыльце березы, оценить перекрестную реактивность с аллергенами других растений и пищевых продуктов, прогнозировать эффективность аллергенспецифической иммунотерапии.

Синонимы русские
Специфические иммуноглобулины класса Е к мажорному аллергену пыльцы березы Betv1 PR-10.

Синонимы английские
ImmunoCAP t215 (Birch, rBet v1 PR-10), IgE; Silver Birch recombinant (rBet v1 PR-10) IgE Ab in Serum; Silver Birch (rBet v1 PR-10) IgE.

Метод исследования

Реакция иммунофлюоресценции на трехмерной пористой твердой фазе, ИФЛ (ImmunoCAP).

Единицы измерения

kU/l (килоединица на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную или капиллярную кровь.

Аллерген – это вещество, вызывающее аллергическую реакцию. При атопических заболеваниях аллергены стимулируют образование антител класса IgE и являются причинными факторами развития клинических симптомов аллергических заболеваний.

Выявление в крови специфических иммуноглобулинов Е к определенному аллергену подтверждает его роль в развитии аллергической реакции I типа (реагиновой), а значит, позволяет определить возможного «виновника» аллергии и назначить соответствующие лечебные и профилактические мероприятия.

Однако в состав аллергенного вещества входит не один, а несколько белковых структур, которые могут выступать аллергенами. Одни являются «мажорными» -основными аллергенами, другие «минорными» – второстепенными. Определение антител к рекомбинантным аллергенам позволяет выявить ведущий компонент в составе сложных аллергенов на уровне молекулярной аллергологии.

Это позволяет дифференцировать истинную и перекрестную аллергию.

Применение рекомбинантных аллергенов представляет собой новый инструмент в диагностике аллергических реакций I типа, который позволяет получить подробную информацию о сенсибилизации пациента, перекрестной реактивности с другими аллергенами, обосновать целесообразность и прогнозировать эффективность аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ).

Пыльца березы является основным и наиболее распространенным триггером аллергических реакций в весенний период, которые проявляются аллергическим ринитом, конъюнктивитом, обострениями бронхиальной астмы и атопического дерматита, симптомами орального аллергического синдрома.

При аллергологическом тестировании обычно определяется сенсибилизация к пыльце березы, как сложному аллергену, который одновременно включает в себя несколько аллергенных компонентов (Betv 1, Betv 2, Betv 3, Betv 4, Betv 5, Betv 6, Betv 7).

  Определение специфических антител IgE к отдельным аллергенным молекулам, рекомбинантным аллергенам, полученным методом генной инженерии позволяет дифференцировать истинную сенсибилизацию и перекрестную реактивность.

Особенно важно учитывать это при планировании АСИТ с аллергенами пыльцы березы, поскольку она может быть эффективной только при истинной аллергии. 

Истинная аллергия к пыльце березы подтверждается наличием в крови специфических антител IgE к аллергокомпоненту Betv1 – белку PR-10, рибонуклеазе, патогенетически связанному с развитием сенсибилизации к пыльце березы протеину. IgE-антитела к аллергену Betv1 выявляются у более 95% пациентов, сенсибилизированных к пыльце березы.

PR-10 – термолабильный белок, аллергенные свойства которого снижаются после термической обработки, а также при распаде в пищеварительном тракте.

Структура PR-10 гомологична белкам пыльцы других деревьев из семейств Березовых, Буковых, Ореховых и таксономически связанных фруктов (яблоки, абрикосы, персики, черешня), овощей (морковь, сельдерей) и специй.

В виду вышеуказанного, у лиц, сенсибилизированных к белку PR-10, кроме респираторных симптомов на пыльцу нередко при употреблении в пищу фруктов, некоторых овощей, орехов наблюдаются локальные проявления аллергии – оральный аллергический синдром в виде зуда, жжения, отека, покраснения в ротовой полости.

Целью данного исследования является определение специфических IgE к рекомбинантному аллергену пыльцы березы rBetv1 методом ImmunoCAP.

Аллергодиагностика технологией ImmunoCAP характеризуется высокой точностью и специфичностью, что достигается обнаружением в очень малом количестве крови пациента низких концентраций IgE-антител.

Исследование основано на иммунофлюоресцентном методе, что позволяет увеличить чувствительность в несколько раз по сравнению с другими диагностическими методами. Во всем мире до 80% определений специфических иммуноглобулинов IgE выполняется данным методом.

Всемирная Организация Здравоохранения и Всемирная Организация Аллергологов признают диагностику с использованием ImmunoCAP как «золотой стандарт», так как эта методика доказала свою точность и стабильность результатов в независимых исследованиях.

Для чего используется исследование?

•          дифференциальная диагностика истинной аллергии к пыльце березы и аллергических реакций, обусловленных перекрестной реактивности с другими аллергенами растительного происхождения;
•          выявление сенсибилизации к главному аллергену пыльцы березы у пациентов с аллергией на пыльцу деревьев и трав и/или поливалентной сенсибилизацией;
•          определение возможных причин перекрестной реактивности между аллергенами различных растений и продуктов растительного происхождения;
•          решение вопроса о целесообразности проведения и прогнозирование эффективности аллергенспецифической терапии (АСИТ) с аллергенами пыльцы березы.

Когда назначается исследование?

•          при обследовании пациентов, сенсибилизированных к пыльце березы и других деревьев;
•          при обследовании пациентов с поливалентной сенсибилизацией к аллергенам растительного происхождения;
•          при планировании АСИТ с аллергенами пыльцы березы.

Что означают результаты?

Референсные значения:

Значение показателякЕдА/л	Класс	Уровень аллергенспецифических антител IgE
0 – 0,35		Отсутствует
0,351 – 0,69	1	Низкий
0,70 – 3,49	2	Средний
3,5 – 17,49	3	Высокий
17,5 – 49,99	4	Очень высокий
50,0 – 100,0	5	Насыщенно высокий
Больше 100,0	6	Крайне высокий

Причины положительного результата:

•   сенсибилизация к главному аллергену пыльцы березы.

При выявлении сенсибилизации к аллергену Betv1 и отсутствием IgE-антител к аллергенам Betv2 и Betv4 высокая вероятность успешной АСИТ.

У пациентов с истинной аллергией на пыльцу березы (наличием IgE-антител к Betv1) и одновременной сенсибилизацией к минорным аллергенам Betv2 и Betv4 вероятность успешной АСИТ снижается.

Причины отрицательного результата:

•   отсутствие сенсибилизации к данному аллергену;
•   длительное ограничение или исключение контакта с аллергеном;
•   успешное проведение АСИТ.

При отсутствии сенсибилизации к Betv 1 АСИТ с аллергенами пыльцы березы будет неэффективной.

Важные замечания

Выполнение данного исследования безопасно для пациента по сравнению с кожными тестами (invivo), так как исключает контакт пациента с аллергеном. Прием антигистаминных препаратов и возрастные особенности не влияют на качество и точность исследования.

Также рекомендуется

[02-029] Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)

[08-017] Суммарные иммуноглобулины E (IgE) в сыворотке

[21-673] Аллергочип ImmunoCAP 

[40-442] Аллергологическое обследование при астме/рините

[21-657] Аллерген t3 – береза бородавчатая, IgE (ImmunoCAP)

[21-665] Панель аллергенов деревьев tx5 (ImmunoCAP), IgE: ольха серая, лещина, вяз, ива, тополь

[21-664] Панель аллергенов злаковых трав gx1 (ImmunoCAP), IgE: ежа сборная, овсяница луговая, плевел, тимофеевка луговая, мятлик луговой

[21-670] Панель аллергенов сорных трав wx3 (ImmunoCAP), IgE: полынь, подорожник ланцетовидный, марь, золотарник, крапива двудомная

+ определение специфических иммуноглобулинов класса E к прочим аллергенам

Кто назначает исследование?

Аллерголог, пульмонолог, оториноларинголог, дерматолог, гастроэнтеролог, педиатр, терапевт, врач общей практики.

Литература

1. Mothes N, Valenta R. Biology of tree pollen allergens. Curr Allergy Asthma Rep 2004;4(5):384-90
2. Rossi RE, Monasterolo G, Monasterolo S. Detection of specific IgE antibodies in the sera of patients allergic to birch pollen using recombinant allergens Bet v 1, Bet v 2, Bet v 4: evaluation of different IgE reactivity profiles. Allergy 2003 ;58(9):929-32
3. Kazemi-Shirazi L, Niederberger V, Linhart B, Lidholm J, Kraft D, Valenta R. Recombinant marker allergens: diagnostic gatekeepers for the treatment of allergy. Int Arch Allergy Immunol 2002;127(4):259-68
4. Valenta R, Duchene M, Pettenburger K, Sillaber S, Valent P. Identification of profilin as a novel pollen allergen; IgE autoreactivity in sensitized individuals. Science 1991;253:557-60

Источник: https://helix.ru/kb/item/21-681

AlkorBio Group. Рекомбинантные аллергены – расширение возможностей in vitro аллергодиагностики

Что это за разработка, способна ли эта инновация  изменить подход к  выявлению  аллергии и почему сегодня ученые все чаще обращаются к теме аллергодиагностики, – об этом мы беседуем с руководителем лаборатории молекулярной диагностики компании «Вега» ГК Алкор Био Александром Павловым.

– Александр, я правильно понимаю, что вы первые в России приступили к разработке  рекомбинантных аллергенов для широкого применения в лабораторной диагностике?

– Да, сегодня в России  никто кроме нас не производит рекомбинантные аллергены для использования в составе тест-систем.

Наверняка в научных лабораториях такие разработки ведутся, но их применение  не выходит за рамки лабораторных нужд.

Западные разработчики здесь на шаг впереди нас: существует, по крайней мере, четыре компании, в Швеции, Германии, Франции и США, которые производят рекомбинантные аллергены и предлагают их для in vitro аллергодиагностики.

– В настоящее время в Алкор Био производится 154 аллергенов, получаемых из природного сырья. Зачем вы начали  разрабатывать синтетические аллергены?<\p>

– В нашей компании четыре года назад стартовал проект по созданию панели аллергенных экстрактов для применения в in vitro аллергодиагностике.

Способ получения экстрактов достаточно универсален для разного рода аллергенов, хотя, конечно, каждый аллерген требует своего собственного подхода. Этот способ заключается в тотальном экстрагировании из вещества всего содержащегося в нем белка, будь то пищевой, пыльцевой или  бытовой аллерген.

На выходе мы получаем раствор, содержащий компоненты искомого вещества. При этом мы оцениваем компонентный состав, определяем общее содержание белка и иммунологические свойства.

Если иммунологические свойства, то есть эффективность выявления иммуноглобулинов класса Е (IgE) в крови у пациентов, страдающих от этого типа аллергии, достаточно высока, то данный экстракт может быть использован для диагностики аллергии.

Этот метод был разработан еще в 70-ых годах прошлого века и в настоящее время широко применяется в аллергодиагностике. С использованием таких экстрактов также проводятся так называемые кожные скарификационные и аппликационные тесты,  аллергоспецифическая иммунотерапия.  

Однако, по мере развития аллергодиагностики, оказалось, что специфичность этого метода, зачастую, несколько ниже, чем хотелось бы. И у данного явления есть несколько причин, одна из которых – вариабельность аллергенных экстрактов.

То есть, к примеру, пыльца деревьев раннего цветения, полученная в средней полосе России, отличается от таковой же, но полученной в южных широтах. Следовательно, есть вероятность, что не будет полного совпадения и у полученных из этого сырья экстрактов.

Кроме этого выделение экстрактов может происходить немного по-разному у разных производителей.

И третье – сам подход к выделению аллергенных экстрактов не дифференцирован по отношению к аллергенным компонентам, которые вызывают аллергию, а направлен на выделение как можно большего количества тотального белка.

– То есть в экстракте, выделенном из какого-то определенного сырья, может содержаться сразу несколько аллергенных компонентов?

– Да, во многих субстанциях аллергенные компоненты представлены не одним белком, а целым набором: двумя, тремя и даже десятью белками. И каждый из них сам по себе может вызывать реакцию. Причем, у разных людей спектр чувствительности в пределах одного аллергена может различаться. Например, рассмотрим такой распространенный аллерген, как пыльца березы.

Основной аллергенный компонент пыльцы березы вызывает аллергию в 95% случаев, когда у людей наблюдается аллергическая реакция на пыльцу березы, но есть и другие компоненты, у одних пациентов они могут вызывать аллергию, у других – нет.

 Но нередко аллергенный компонент, который присутствует в растворе в очень небольших количествах, то есть является минором, вызывает довольно сильную аллергическую реакцию, то есть с точки зрения аллергодиагностики является мажором.

Может быть и такая  ситуация, когда аллергены, не имеющие мажорных компонентов, с той или иной частотой вызывают аллергическую реакцию. И все эти особенности могут приводить к  возникновению проблем при использовании аллергенных экстрактов недифференцированно.

Кроме этого все аллергены можно объединить в несколько так называемых суперсемейств. И внутри одного такого суперсемейства белки очень похожи. То есть это некие эволюционно консервативные структуры, белки, которые могут встречаться в широком спектре окружающих нас веществ.

Поэтому, например, такая проблема как неспецифичность и кросс-реактивность аллергенных компонентов часто бывает вызвана очень высокой степенью гомологии белков из разных природных источников.

Например, когда мы диагностируем аллергию к пыльце березы и, действительно, видим, что по результатам in vitrо теста у человека обнаруживается гиперчувствительность, это не означает на 100%, что мы поставим верный диагноз. Потому что основной компонент пыльцы березы встречается и во многих пищевых продуктах: в яблоке, груше, персике.

То есть человек уверен, что у него аллергия на березу, а оказывается, что у него аллергия, скажем,  на яблоко. Потому что эти аллергены очень похожи. И таких примеров достаточно много.

Поэтому-то аллергия такое многофакторное заболевание: если у вас развился аллергический ответ на один из таких белков, то тут же может появиться ответ сразу на несколько других аллергенов.

При этом если аллерген определен не верно, нельзя назначать аллергоспецифическую терапию, когда пациенту проводят терапевтический курс инъекций аллергена,  чтобы выработать невосприимчивость к нему. Эта процедура очень длительная, занимает, зачастую, несколько лет и стоимость ее – десятки тысяч рублей. А в случае, если  диагноз поставлен неправильно – неправильно определен тип аллергии, неверно определен основной аллерген –  это может вызвать совершенно противоположную реакцию. То есть у пациента появляется аллергическая реакция на то, на что ее прежде никогда не было.     

Частичным решением вопроса может быть обогащение существующих экстрактов целевыми веществами, теми, которые мы хотим изучать, то есть аллергенными компонентами, либо использовать эти аллергенные компоненты независимо. Для того,  чтобы более специфично и надежно поставить диагноз.

– Как это можно сделать? Как в процессе диагностирования аллергии избежать ошибок?

– Первый подход самый простой, когда мы берем какое-то вещество и разделяем его на компоненты, то есть отсеиваем все неаллергенные и берем только аллергенные в большей концентрации. И затем каждый компонент используем независимо.

Такой подход имеет право на жизнь, к примеру, когда мы говорим о таком  распространенном аллергене, как белок яйца. Здесь присутствуют такие вещества, как  овальбумин и овомукоид, каждый из них является аллергеном, но нередко бывает, что одни аллергики реагируют только на овальбумин, а другие – только на овомукоид.

  И овальбумин и овомукоид  присутствуют в яйце в высокой концентрации. Поэтому мы можем при помощи нехитрых биохимических манипуляций выделить эти вещества в чистом виде и затем использовать в аллергодиагностике независимо друг от друга.

Но есть гораздо более сложные варианты, когда минорный компонент, то есть компонент, которого очень мало, является сильным аллергеном. Тогда для выделения этого компонента из природного источника приходится применять сложные селективные методы.

Например, если есть вещество, имеющее сродство к данному аллергенному компоненту, его добавляют к раствору аллергена, все это вместе отбирают и таким образом получают сильно обогащенную фракцию. То же самое можно сделать методом жидкостной хроматографии. Но далеко не к каждому аллергенному компоненту можно подобрать такое селектирующее вещество.

– И что делать в этом случае?

– Получить эти белки искусственно. Это и есть так называемая технология рекомбинантных белков. Ее суть заключается в том, что мы используем чужеродный организм для высокопроизводительной наработки интересующего нас вещества.

Например, если требуемый белок – растительный, можно использовать бактерию: внедрить в нее ген или участок гена, который отвечает за экспрессию, синтез необходимого нам белка. В этом случае мы говорим о технологии молекулярного клонирования, когда из генома растения вырезается определенный участок и затем вставляется в геном бактерии.

После чего мы заставляем бактерию этот белок производить. В настоящее время уже описано огромное количество аллергенных компонентов и участков геномов, которые ответственны за их синтез. То есть имеется достаточное количество информации для получения широкого спектра рекомбинантных белков.

Но здесь возникает другая проблема: да, белок при помощи этой технологии мы можем получать в неограниченных количествах, но прежде чем его использовать в аллергодиагностике, необходимо его протестировать на эффективность, а также верифицировать, то есть проверить, насколько этот белок обладает теми свойствами, которые мы от него ожидаем.

И это большой пласт работы, который следует сразу за получением искомого белка. Здесь применяется широкий спектр иммуноферментных методов, требуется большая выборка положительных и отрицательных сывороток, чтобы показать: вещество, которое мы получили – аналогично аллергенному экстракту, которое мы таким образом замещаем и/или дополняем.

В  лаборатории аллергологии ГК Алкор Био была создана большая панель  аллергенных экстрактов, а также тест-система для in vitrо аллергодиагностики, был собран большой банк сывороток крови пациентов и в настоящее время все эти наработки могут быть использованы для создания панели рекомбинантных белков.

Я уверен, что в дальнейшем панель аллергенов ГК Алкор Био будет расширяться, в том числе, и за счет рекомбинантных белков, хотя, конечно, процесс их получения трудоемкий и длительный.

В первую очередь имеет смысл начинать разработку белков, которые представляют наибольшую угрозу в плане получения ложных результатов, как, например, вышеупомянутый белок пыльцы березы rBetv1 – мажорный белок, проявляющий кросс-реактивность.

Использование  рекомбинантных аллергенов позволит снизить вероятность ошибки при постановке диагноза, это – хорошее дополнение к панели аллергенных экстрактов, расширение которой в Группе компаний Алкор Био активно продолжается.

Анна Соснора

Источник: http://www.alkorbiogroup.ru/statyi/rekombinantnye_allergeny_-_rasshirenie_vozmozhnostej_in_vitro_allergodiagnostiki